Pierwszy ośrodek powstał przy ulicy Jungmannova, później przeniesiono go do dzielnicy Jinonice. Jednak już w czasach dyktatury komunistycznej kilka osób miało kontakt z Dziełem dzięki księżom i świeeckim mieszkającym w Wiedniu.

Zmianą w pracy apostolskiej było otwarcie Univerzitního centra Na Baště
w Pradze w 1996 roku. Centrum nadal oferuje zakwaterowanie studentom uniwersytetu, aby przyczynić się do ich osobistego rozwoju.

Ponadto otwarto Kulturní a studijní centrum Pětidomí  dla Kobiet. W Pradze znajduje się również Vzdělávací centrum Bělohorská poświęcone zajęciom dla dziewcząt.

Apostolat wiernych Dzieła nie ograniczał się do działalności w Pradze, ale wkrótce rozpoczęły się regularne wyjazdy do Brna. Pierwszy ośrodek został otwarty w 2006 roku. Obecnie praca apostolska dla mężczyzn prowadzona jest w Centrum Studenckim U Pálavy, a dla kobiet w Centrum Edukacyjnym Brunea, które służy również jako akademik dla studentek.

W 2007 r. w ramach Prałatury Opus Dei utworzono odrębny region o nazwie Czechy i Słowacja, który ma własne kierownictwo z siedzibą w Pradze. Na czele regionu stoi wikariusz regionalny, który zarządza pracą apostolską wraz z organami doradczymi dla mężczyzn i kobiet w Czechach i na Słowacji.

Dla potrzeb apostolskich Opus Dei służy Centrum Edukacyjne Palouček w Bělokozly koło Sázavy. Tutaj odbywają się ćwiczenia duchowe, zajęcia edukacyjne i inne wydarzenia o charakterze duchowym lub edukacyjnym.

Obecnie regularne zajęcia Opus Dei odbywają się w Pradze, Brnie, Ołomuńcu, Rakovníku, Třebíču i Kroměřížu.