Medarbetare i Opus Deis är män och kvinnor som, utan att tillhöra prelaturen, hjälper till med olika verksamheter såsom utbildning, sjukvård, sociala och kulturella projekt osv. tillsammans med prelaturens medlemmar.
Medarbetarna kan medverka i dessa initiativ främst med sin bön men även genom sitt arbete eller med ekonomiska bidrag.
De får del av de andliga förmåner som Kyrkan har beviljat dem som samarbetar med Opus Dei: avlat som medarbetarna kan vinna på särskilda dagar under året genom att följa de villkor som fastställts av Kyrkan, och varje gång de av vördnad förnyar sina förpliktelser som medarbetare.
Från prelaturen Opus Dei får de därtill den andliga hjälp som består i alla medlemmars förböner och möjligheten att, om de så önskar, delta i reträtter, cirklar eller andra utbildningsmedel.
För att vara medarbetare behövs inte någon särskild kallelse. Vanligtvis är det släktingar, vänner, arbetskamrater och grannar till Opus Deis medlemmar som blir medarbetare, eller sådana som har vördnad för den helige Josemaría, som deltar i prelaturens apostolat eller intresserar sig för den personliga och sociala utveckling som främjas genom de apostoliska initiativ som Opus Deis medlemmar driver.
Utnämningen av en medarbetare godkänns av den person som leder det apostoliska arbetet på en viss plats, på förslag av en medlem av Opus Dei.
Bland Opus Deis medarbetare finns katoliker, kristna från andra samfund och troende från andra religioner. Även människor som inte är troende eller som inte bekänner sig till någon religion kan bli medarbetare. Det som förenar dem är en önskan att medverka vid olika initiativ till förmån för samhället som är öppna för alla.
De medarbetare som vill kan delta i de utbildningsmedel som prelaturen Opus Dei erbjuder. De får därigenom hjälp att fördjupa sitt andliga liv, att med gärningar stödja påven och biskoparna samt att personligen, utan att bilda en grupp, vittna om sin tro i enlighet med sin kristna kallelse.
Många personer upptäcker under dessa utbildningsmedel en möjlighet till att i sin egen omgivning utöva och sprida ett av de grundläggande kännetecknen i Opus Deis anda: helgandet av det vanliga arbetet samt familje- och samhällsplikterna.
Även ordenskommuniteter kan utnämnas till Opus Deis medarbetare. Dessa kommuniteter, som för närvarande uppgår till omkring 500, medverkar till prelaturens verksamhet genom sin dagliga bön.