Zij begon in 1941 met haar loopbaan als lerares en kon met haar inkomen ook haar familie financieel ondersteunen. In 1944 leerde ze de heilige Jozefmaria Escrivá, de stichter van het Opus Dei, kennen. Hij hielp haar ontdekken dat ze Christus kon ontmoeten in het beroepswerk en in het gewone leven. Kort daarop vroeg zij om toelating tot het Opus Dei.
Vanaf dat moment zocht ze met een onvoorwaardelijke overgave de intimiteit met God en zette ze zich voor diverse apostolische activiteiten in, zoals voor de facilitaire dienst van twee studentenhuizen in Madrid en Bilbao, waar ze les gaf aan de jonge vrouwen die daar werkten. Ze nam de leiding op zich van een studentenhuis voor vrouwelijke studenten in Madrid.
Vanwege haar edelmoedigheid, sterkte en vreugde vroeg de stichter van het Opus Dei haar in 1950 om het apostolaatswerk van de vrouwen in Mexico te beginnen. Op 5 maart vertrok ze naar haar nieuwe land. Daar leidde ze weer een studentenhuis voor vrouwelijke studenten. Ze stimuleerde hen hun menselijke en christelijke vorming te verdiepen en hun kennis in dienst van anderen te stellen. Daarnaast zocht ze de medewerking van vrouwen – al dan niet met een baan buitenshuis – en probeerde onder hen het christelijk geloof te verspreiden.
In 1956 verhuisde Guadalupe naar Rome en een jaar later keerde ze terug naar Spanje. Er werd een ernstige hartziekte geconstateerd, waaraan ze geopereerd moest worden. Na haar herstel promoveerde ze cum laude in de scheikunde, ontving ze de onderzoeksprijs Juan de la Cierva en werd ze docent aan een openbare hogeschool. Daarnaast had ze vormings- en bestuurstaken binnen het Opus Dei.
Tot aan het einde van haar leven werd ze geleid door het diepe verlangen de mensen om haar heen dichter bij God te brengen door haar vreugde en vriendschap. Op 16 juli 1975 overleed ze in Pamplona in faam van heiligheid. Op 5 oktober 2018 is haar stoffelijk overschot verplaatst van Pamplona naar de kapel van Caballero de Gracia in Madrid.
Het zaligverklaringsproces is in Madrid geopend op 18 november 2001. Het onderzoek over haar leven, haar deugden en de geur van heiligheid werd op 18 maart 2005 afgesloten. Tijdens het onderzoek werden 32 getuigen gehoord in Madrid en 22 in Mexico Stad.
Op 17 februari 2006 decreteerde de Congregatie voor de Heiligverklaringen voortzetting van het proces en op 4 augustus 2009 werd de Positio over het leven en deugden van Guadalupe ingediend, bestaande uit vier delen (geschiedenis en bronnen, een uitgebreide biografie, kritische studie over de deugden, verklaringen van getuigen en geschriften).
Op 7 juni 2016 adviseerden de theologische consultoren positief ten aanzien van de heldhaftige uitoefening van de deugden door Guadalupe Ortiz de Landazuri. Op 2 mei 2017 spraken kardinalen en bisschoppen tijdens een vergadering zich ook positief uit.
Op 4 mei 2017 ontving paus Francis van kardinaal Angelo Amato, prefect van de Congregatie voor de Heiligverklaringen, een gedetailleerd verslag over de fasen van het proces en bevestigde hij de conclusie van de Congregatie: Guadalupe Ortiz de Landazuri mag 'eerbiedwaardige dienares Gods' worden genoemd.
Op 8 juni 2018 autoriseerde paus Franciscus de publicatie van een decreet van de Congregatie voor de Heiligverklaringen waarin een wonder op voorspraak van Guadalupe wordt erkend.
Op 18 mei 2019 vond de zaligverklaring van Guadalupe plaatst in Madrid, haar geboortestad.