Keanggotaan dalam Opus Dei memerlukan adanya panggilan adikodrati, yang merupakan panggilan pribadi dari Allah untuk menempatkan seluruh kehidupannya untuk melayani Tuhan dengan menyebarkan pesan panggilan kepada seluruh umat manusia untuk mengkudusan diri melalui pekerjaan sehari-hari dan dalam kehidupan bermasyarakat. Para anggota bergabung melalui sebuah komitmen berupa janji, bukan sumpah, dan mereka tetap merupakan anggota awam dari keuskupan tempat mereka tinggal. Panggilan ini biasanya mulai bisa dilihat setelah mengikuti kegiatan-kegiatan Opus Dei (retreat, kelas, bimbingan rohani) secara rutin selama satu periode waktu tertentu, yang memungkinkan mengenal Opus Dei secara sungguh-sungguh. Juga penting baginya untuk dapat menjalankan praktek-praktek Kristiani secara konsisten dimana dia telah berjanji untuk melakukannya : menerima Sakramen-Sakramen secara sering, menjalani hidup doa, merasul dan, secara umum, berusaha dengan rendah hati dan berkesinambungan untuk melaksanakan berbagai keutamaan serta berjuang untuk mencapai kekudusan sesuai dengan semangat Opus Dei. Semua orang Katolik, pria ataupun wanita, menikah ataupun yang masih lajang, dari latar belakang social, ekonomi serta kebangsaan apapun dapat bergabung ke dalam Prelatur.