O trabalho apostólico do Opus Dei no Brasil teve início em 1957, em Marília, no Estado de São Paulo. Devido ao interesse e à prolongada insistência do então bispo dessa diocese, D. Hugo Bressane de Araújo, São Josemaria Escrivá decidiu que fosse erigido um primeiro Centro do Opus Dei no Brasil, na jovem cidade da Alta Paulista e para ela se transferiram alguns membros da Obra, entre eles o Pe. Jaime Espinosa Anta, licenciado em medicina e doutor em direito canónico, o médico recém-formado José Luís Alonso Nieto, e o jovem advogado Félix Ruiz Alonso.
Neste mesmo ano, abriu-se também em Marília o primeiro Centro feminino. Entre outras vieram iniciar o trabalho do Opus Dei no Brasil Gabriela Malvar Fonseca (professora), Rosário Alonso (nutricionista) e Maria Clara Constantino (professora de filosofia).
Conforme estava programado desde o início, em 1958 iniciaram o trabalho apostólico do Opus Dei na cidade de São Paulo, primeiro utilizando-se um pequeno apartamento na Rua Piauí, emprestado por um amigo; pouco depois, a partir de Fevereiro de 1959, já num Centro, numa casa alugada – a Residência Universitária do Pacaembu, na Rua Gabriel dos Santos, nº 370. O Centro foi erigido com a vénia do cardeal D. Carlos Carmelo de Vasconcellos Motta. Da mesma forma, um ano depois, em Maio de 1960 foi erigido um Centro feminino, a Residência Universitária Jacamar, que teve a sua primeira sede na Rua Gabriel Monteiro da Silva, nº 613.
Em 1961, chegou ao Brasil o Pe. Xavier de Ayala Delgado, juntamente com outros membros do Opus Dei procedentes de Espanha e de Portugal, para impulsionar o trabalho apostólico que, naquela altura, já se revelava promissor. O Pe. Xavier foi o Vigário Regional até à sua morte em 1994.
A partir daí, foram-se desenvolvendo os diversos trabalhos apostólicos do Opus Dei, entre jovens estudantes e operários, profissionais, solteiros e casados, sacerdotes diocesanos – através de cursos de doutrina católica, círculos de formação humana, profissional e cristã, retiros, etc. – sempre com o espírito de procura da santidade cristã no meio do mundo, através da santificação do trabalho e dos deveres quotidianos, que é o espírito próprio do Opus Dei.
Tendo Deus abençoado esses trabalhos com um número crescente de conversões, a partir da vivência cristã e de vocações de homens e mulheres, novos Centros masculinos e femininos foram sendo erigidos em São Paulo e, já em 1967, iniciou as suas actividades (encontros de formação cultural e espiritual, cursos de teologia para leigos, retiros espirituais para leigos e também para sacerdotes diocesanos, etc.) o Centro de Convívios Sítio da Aroeira, construído no município paulista de Santana do Parnaíba. Pouco tempo depois, um Centro análogo, denominado Casa do Moinho, localizado no município de Cotia, iniciava esse tipo de actividades.
O primeiro membro brasileiro do Opus Dei que se ordenou sacerdote foi Mons. Pedro Barreto Celestino. Após vários anos de preparação em Roma, junto do Fundador, recebeu a ordenação sacerdotal em 1971.
Um marco decisivo para o desenvolvimento do trabalho apostólico do Opus Dei foi a estadia em São Paulo de São Josemaria Escrivá, entre 22 de Maio e 7 de Junho de 1974. Muitas pessoas tiveram a oportunidade de o conhecer e de o ouvir em encontros de catequese, que chegaram a reunir mais de 3.000 participantes no Parque Anhembi e perto de 2000 no Auditório Mauá. No dia 28 de Maio, São Josemaria, acompanhado por numerosos fiéis do Opus Dei, cooperadores e amigos, realizou uma romaria ao Santuário Nacional de Nossa Senhora Aparecida.
Com o incentivo de São Josemaria e as bênçãos de Deus, a partir de 1975, o trabalho estável do Opus Dei foi-se estendendo rapidamente pelo país, com variadas iniciativas de carácter cultural, social e apostólico iniciadas no Rio de Janeiro, Curitiba, Brasília, Porto Alegre, Belo Horizonte, Campinas, Londrina, Niterói, São José dos Campos e Ribeirão Preto, sendo que, em várias outras cidades, há fiéis do Opus Dei que promovem actividades formativas, sociais e apostólicas de diversos tipos.
Actualmente, o Opus Dei conta, no Brasil, com 1.700 fiéis, dentre os quais 40 sacerdotes incardinados na Prelatura do Opus Dei e outros 20 em diversas dioceses.