Die Mitarbeiter können die Initiativen in erster Linie durch ihr Gebet unterstützen.
Viele kommen aus dem Freundes-, Kollegen- oder Bekanntenkreis von Mitgliedern des Opus Dei. Andere lernen die Prälatur durch ihre Verehrung des hl. Josefmaria oder durch Interesse an ihren Bildungs- und Sozialinitiativen kennen. Sie helfen durch Gebet, persönliche Mitarbeit oder finanzielle Beiträge bei sozialen, kulturellen und Bildungsinitiativen.
Mitarbeiter können Katholiken, Christen anderer Konfessionen, Angehörige anderer Religionen und auch Menschen ohne religiösen Glauben sein. Sie verbindet die Bereitschaft, Initiativen des Opus Dei zum Wohl der Gesellschaft zu unterstützen.
Auch Ordensgemeinschaften können Mitarbeiter des Opus Dei sein. Gegenwärtig beten etwa 500 Gemeinschaften für das Opus Dei und unterstützen auf diese Weise sein Apostolat in aller Welt.
Die Kirche gewährt den Mitarbeitern des Opus Dei bestimmte geistliche Güter, vor allem den Gewinn von Ablässen an bestimmten Tagen des Jahres. Außerdem können sie auf das Gebet der Mitglieder des Opus Dei zählen und selbstverständlich vom Bildungsangebot (Besinnungsstunden, Bildungskreise usw.) der Prälatur Opus Dei Gebrauch machen.
Viele entdecken dabei die Möglichkeit, in ihrem natürlichen Umfeld einen wesentlichen Aspekt des Geistes der Prälatur Opus Dei umzusetzen und weiterzutragen, nämlich die Heiligung der gewöhnlichen Arbeit und der familiären und gesellschaftlichen Pflichten.